3 Passos importantes na realização da CLAE (2/3)

  2. Como otimizar as condições cromatográficas

 (proporção dos componentes da fase móvel e comprimento de onda).

Optimizing chromatographic conditions (the proportion of the components of the mobile phase and wavelength).

Proporção dos componentes:

A medida que modificamos a proporção de reagentes na fase móvel modificamos a polaridade dessa fase assim alteramos o tempo de análise, por exemplo no caso da cafeína a medida que mudamos a proporção de 35:65 para 40:60 diminuímos o tempo de análise de 8,221 minutos para 6,717 minutos essa foi uma forma de otimizar a análise.

Comprimento de onda:

Para otimizar as condições cromatográficas em relação ao comprimento de onda, devemos trabalhar no comprimento de onda máximo como é indicado na lei de Beer que no caso da cafeína é de 272nm, porém trabalhamos no comprimento de onda de 254 nm e obtivemos um erro positivo em relação a lei de Beer, o erro foi razoavelmente baixo, devido podermos trabalhar em uma faixa de comprimentos de onda máximo, tanto em relação a área quanto em relação ao tempo, mas o correto para se otimizar uma determinada substância é utilizar o comprimento de onda máximo.

 

Fontes: 

1.Collins. C. H., Braga G. L., Bonato P. S. ; Fundamentos de cromatografia, Ed. Unicamp, 2007.

2. Skoog, West, Holler; Fundamentos de Química Analítica, Ed. Thomson , 8°Ed.

  Postado por Sterffson Jota

Determinação de Ácidos Orgânicos na Rizosfera de Cafeeiro pro Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL)

Objetivando determinar ácidos orgânicos na rizosfera do cafeeiro (Coffea arábica), foram

coletadas amostras de rizosfera em lavoura da Fazenda Experimental da EPAMIG (Lavras-MG). Após adaptação da metodologia, as amostras foram submetidas à extração e os ácidos orgânicos de baixo peso molecular determinados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). O método de extração utilizado detectou, nas amostras analisadas, os ácidos cítrico, oxálico, acético, butírico e propiônico, sendo que os ácidos oxálico, acético e cítrico foram encontrados em maiores quantidades em relação aos demais.

Extração de ácidos orgânicos no solo: A extração foi feita de acordo com a metodologia proposta por Bazimarakenga et al.,(1995), com algumas modificações: Amostras de solo: Foram utilizadas amostras de rizosfera de plantas de cafeeiro (Coffea arabica) das cultivares Mundo Novo, Icatu Amarelo e Catuai Vermelho. A lavoura foi implantada há aproximadamente 4 anos, na Fazenda Experimental da EPAMIG (Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais) em Lavras-MG, em um Podzólico Vermelho Amarelo distrófico, textura argilosa, 2,5% de matéria orgânica. Amostras da rizosfera (solo aderido à raiz) foram coletadas, para avaliar a concentração de ácidos orgânicos exsudados pelas raízes. A primeira etapa do processo consiste em separar a raíz do solo, isso é feito agitando-se levemente a raiz, de modo que reste apenas uma pequena quantidade de solo aderida. Recomenda-se que a profundidade máxima de coleta de raízes deve ser de 15cm. Extração: A combinação raiz + solo (50 g), obtida pelo procedimento descrito anteriormente foi colocada em erlenmayers, sendo adicionados 50mL de água destilada e esse material agitado no escuro por 12h. Em seguida, o sobrenadante da mistura foi centrifugado a 10000rpm por 20min, filtrado em papel filtro tipo Whatman 42. Os ácidos orgânicos foram extraídos com 10ml de acetato de etila, adicionado ao extrato e aquecido em chapa a 45 oC até o ponto de parcial secura, sendo então redissolvido em 1mL de água destilada. Os ácidos orgânicos foram identificados e quantificados por HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) nas seguintes condições: coluna C-18, injeção: 20mL, UV a 230nm, fluxo: 1mL/min e fase móvel: água com 1% de ácido fosfórico. Os picos correspondentes a cada ácido foram identificados pelo tempo de retenção, utilizando-se como comparação os tempos de retenção dos padrões. A concentração obtida foi expressa em mg kg–1 de ácido na rizosfera.

O cromatograma (Figura 1) mostrou picos de resolução relativamente baixa na separação de ácidos orgânicos, sendo que os ácidos avaliados foram identificados num tempo total de análise de 10min. Os tempos de retenção dos ácidos são mostrados na tabela 1. A cromatografia líquida de alta eficiência tem sido usada frequentemente para determinação de ácidos orgânicos de baixo peso molecular coletados em solução nutritiva, ou extraídos do solo. Entretanto, acredita-se que pode haver uma interferência de compostos orgânicos e inorgânicos, quando é usada a faixa de detecção próxima de 210nm, o que prejudica a definição dos picos (Blake et al., 1987). Ácidos como o lático, propiônico, butírico, são suficientemente bem separados usando HPLC. Já outros como cítrico, málico e oxálico não tem picos tão bem definidos (Szmigielska et al.,1997). Esses autores relatam que o tempo necessário para definição dos picos, calibração do aparelho e separação dos ácidos dificulta a utilização do HPLC para análises de rotina.

O método de extração utilizado foi eficiente na extração de ácidos orgânicos, com precisão para diferenciar o potencial de exsudação de ácidos orgânicos na rizosfera de cafeeiro, representando um instrumento com potencial de utilização em programas de melhoramento de plantas. Esse potencial resultaria na obtenção de genótipos com maior eficiência nutricional quando cultivados em solos distróficos.

Fonte:http://www.sbicafe.ufv.br/bitstream/handle/10820/321/155537_Art365f.pdf?sequence=1/ BAZIMARAKENGA,B.;SIMARD,R.R. e LEUROX, G.D. Determination of organic acids in soil extracts

by ion chromatography. Soil Biology and Biochemistry,v.27,p.349-356.1995.

Postado por Luma Mendes

Sistema de Injeção - CLAE/HPCL

Sistema de introdução da amostra   

Existem basicamente 3 tipos de injetores: seringa, válvula e automáticos

1. Injetores tipo seringa: 

    

   

Vantagens: são baratos.
Desvantagens: - aplica a amostra diretamente na coluna,
                           - dificuldade de injetar volumes precisos,
                           - deve-se vencer a pressão da bomba.

 

2. Injetores tipo válvula:

 

   

Introdução da amostra é efetuada com um “loop” externo
 

Vantagens: - injeta volumes precisos,
                     - “loop” de diferentes tamanhos (mais utilizados: 20 e 100 µL).

                           Injetor do tipo válvula Rheodyne

                       Posição de carregamento                          Posição Injeção

             

3. Injetores automáticos:

      

- São injetores de válvula controlados por microprocessador;
- Permite Injetar diferentes volumes das amostras que são colocadas em um carrossel,   conforme programação prévia;
- A pressão da seringa é suficiente para a amostra passar a válvula de controle.
 

Vantagens: - todas as do injetor tipo válvula
                     - injeta amostras automaticamente
Desvantagens: - preço

 

Referência: Prof. Dr. Renato Zanella. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Disponível em: <http://w3.ufsm.br/larp/media/hplc_geral_colorido.pdf>. Acesso em 25 abr. 2012

Postado por Ana Brígida

3 Passos importantes na realização da CLAE (1/3)

1. Mecanismo de separação em cromatografia líquida em fase reversa:

Separation mechanism in reverse phase liquid chromatography;

     O tipo de CLAE mais utilizado é a cromatografia por partição, na qual a fase estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel. A cromatografia por partição pode ser subdividida em cromatografia líquido-líquido e cromatografia líquida com fase ligada. A diferença entre as duas está na forma com a qual a fase estacionária é imobilizada nas partículas de suporte do recheio. O líquido é imobilizado por adsorção física em cromatografia líquido-líquido, enquanto é retido por meio de ligações químicas na cromatografia líquida com fase ligada. Inicialmente a cromatografia por partição era exclusivamente do tipo líquido-líquido; atualmente, contudo, os métodos de fase ligada predominam por causa de sua maior estabilidade. Os recheios do tipo líquido-líquido estão hoje em dia relegados a certas aplicações especiais. O método consiste de uma fase líquida (estacionária) que por absorção física é retida na superfície da coluna empacotada geralmente com sílica e de uma fase móvel, também líquida, que passa sobre esta fase estacionária sendo uma destas polar e a outra apolar. A separação baseia-se na solubilidade da amostra em relação ao solvente (fase móvel) e a fase estacionária, sendo assim os componentes da amostra que são mais solúveis na fase móvel são eluidos primeiro enquanto os que têm maior afinidade com a fase estacionária são seletivamente retidos por ela.

 Figura: Diagrama de blocos mostrando os componentes típicos de um sistema CLAE

Referência:
1. Collins. C. H., Braga G. L., Bonato P. S. ; Fundamentos de cromatografia, Ed. Unicamp, 2007.

2. D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman, Princípios de Análise Instrumental, 5ª Ed., Bookman, 2006. Link para passo (2/3):  http://graduandosfarmacia.blogspot.com.br/2014/04/3-passos-importantes-na-realizacao-da.html  Link para passo (3/3: http://graduandosfarmacia.blogspot.com.br/2014/05/3-passos-importantes-na-realizacao-da.html

Postado por Sterffson Jota

INJETORES MANUAIS

‐ amostra deve ser aplicada na coluna pressurizada na forma de uma banda estreita‐ válvula de introdução de amostra mais comum: válvula de 6 pórticos (orifícios)‐ alça de amostragem ou loop: comprimento e diâmetro interno definem seu volume.

VISÃO ESQUEMÁTICA DO FUNCIONAMENTO DA VÁLVULA DE 6 PÓRTICOS

Postado por Alana de Jesus.

dia 24/04/2014 - Quinta-Feira.

3º Semestre - Farmácia.

Determinação do teor de omeprazol por cromatografia líquida de alta eficiência em matérias-primas e produtos acabados.

Determination of omeprazole by high performance liquid chromatography efficiency in raw materials and finished products.

Omeprazol, derivado benzimidazólico, é o primeiro da classe de fármacos conhecidos como inibidores da bomba de prótons, e tem se mostrado bastante eficaz em promover potente inibição da secreção gástrica do ácido clorídrico. Deste modo é, utilizado principalmente, no tratamento de úlceras gastrointestinais, refluxo esofágicos e na síndrome de Zollinger-Ellison. É uma substância de caráter lipofílico, e comporta-se como uma base fraca, com pKa 1 = 4,2 e pKa2 = 9,0 (CASTRO et al., 1999). Verificou-se que a potência do omeprazol é muito aumentada em meio ácido, provavemente devido a uma alteração na estrutura da bomba protônica da célula parietal, tornando-a mais susceptível aos efeitos do omeprazol em pH baixo, (SILVA, 2002).

O método foi utilizado para determinar o teor de omeprazol nas matérias-primas e produtos acabados foi descrito pela Farmacopéia Americana (USP-24, 2001). 

A quantificação do teor de omeprazol foi realizado em cromatógrafo líquido Varian modelo Prostar, acoplado com detector UV, software Varian Star Workstation versão 5.0 foi usado para registrar os cromatogramas e medir as áreas de picos. Utilizou-se uma coluna Microsorb-MV100 C8. A cromatografia foi realizada à temperatura 25 °C. A eluição foi realizada com acetonitrila /tampão fosfato de sódio pH 7,6 na proporção de 3:1(v/v) num fluxo de 1ml/min.

Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que 48% das matérias-primas estavam em desacordo com a especificação farmacopeica. Estes resultados permitem sugerir a necessidade de uma melhor qualificação dos fornecedores, além disso, um maior rigor durante o armazenamento dessas matérias-primas nas farmácias, prevenindo da absorção de umidade ou degradação do fármaco. 

Os resultados relativos à análise das cápsulas mostraram que 29% das amostras estavam em desacordo com a especificação farmacopeica (USP-28, 2005), que permite uma variação de 90 à 110% sobre o teor de omeprazol. A qualidade das matérias-primas pode ter influenciado neste resultado, além disso, pode-se sugerir uma revisão nos procedimentos de produção das cápsulas, visando detectar falhas, durante a pesagem, homogeneização e encapsulamento do pó. A técnica CLAE mostrou-se simples, rápida e adequada para quantificação do teor de omeprazol, resultando em picos de boa resolução.

Fonte: www.revistas.ufg.br/index.php/REF/article/viewFile/2016/1983

Revista Eletrônica de Farmácia Suplemento Vol 2 (2), 206-209, 2005.

Postado por Glaycianne Alves

Validação de método para determinação de cotinina em urina por Cromatografia líquida de Alta eficiência.

De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde, o consumo de tabaco representa a segunda maior causa de mortes no mundo, ocorrendo 5 milhões de óbitospor ano em decorrência deste hábito, correspondendo a cerca de 6 mortes por segundo (ARAUJO et al., 2004; WHO, 2006). Tendo em vista os danos à saúde que esta dependência causa, é crescente a demanda por análises laboratoriais que permitam avaliar a exposição ao tabaco, principalmente em pacientes em tratamento para cessar de fumar ou em indivíduos com suspeita de exposição ambiental à fumaça de cigarro, entre eles crianças e gestantes. Estas análises também são aplicáveis a trabalhadores envolvidos com o cultivo do tabaco, uma vez que pode ocorrer absorção de nicotina via dérmica (DOCTOR et al., 2004).

A cotinina pode ser determinada por diversos métodos, entre eles espectrofotometria, imunoensaios, cromatografia gasosa (CG), cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e CG ou CLAE acoplada à

espectrometria de massas (WATTS et al., 1990; HAUFROID & LISON, 1998; SHIN et al., 2002; DHAR, 2004; KIM et al.,2005).Considerando a melhor relação custo e benefício foi objetivo deste trabalho validar um método por CLAE precedida por extração líquido-líquido para mensurar os níveis de cotinina na urina com a finalidade de monitorar a exposição ao tabaco, incluindo exposição ambiental.

Parâmetros cromatográficos

A separação cromatográfica foi realizada em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Agilent

1100 SERIES (USA), equipado com detector ultravioleta (comprimento de onda de 260 nm), loop de 20µL e coluna Zorbax Eclipse XDB-C8 (4,6mm x 150mm x 5µm Agilent ®). Como fase móvel foi utilizada água Milli-Q:metanol:acetato de sódio 0,1M:acetonitrila (50:15:25:10,v/v) contendo 1 mL de ácido cítrico 0,034M e 5,0mL de trietilamina para cada litro de solução. O pH foi ajustado a 4,4 com ácido acético.

A fase móvel, o comprimento de onda do detector, o tipo de coluna e o volume de extrato injetado foram selecionados através da realização de testes com parâmetros citados por vários autores (CEPPA et al., 2000; GHOSHEH et al., 2000; NAKAJIMA et al., 2000; PAGE-SHARP et al., 2003; HEAVNER et al., 2005).

Procedimento de extração

Para a realização das análises, foram pipetados 2,0 mL de urina centrifugada. Posteriormente foi adicionado 25µL de hidróxido de sódio 10M, 100µL de padrão interno (2-fenilimidazol 1,0µg/mL) e 4,0 mL de diclorometano. A seguir esta solução foi agitada por 40 minutos em homogeneizador e centrifugada por 10 minutos a 3000 rpm. Dois mililitros da fase orgânica foram transferidos para um

frasco evaporador e colocados em termobloco (Pierce®,modelo 18940), sob corrente de nitrogênio e temperatura ambiente, até secura. Posteriormente o resíduo foi reconstituído com 200µL de fase móvel e injetado em CLAE.

Validação analítica

Para a validação do método, foram seguidas as recomendações preconizadas por CHASIN e colaboradores (1998). A linearidade foi determinada pela análise dos calibradores (em triplicata) preparados no próprio laboratório utilizando urina de indivíduos não expostos ao tabaco, com os quais se criou uma curva de calibração com as concentrações de 10,0; 25,0; 50,0; 100,0; 250,0; 500,0 e 1000,0 ng/mL, abrangendo a faixa de interesse do trabalho (SHIN et al., 2002). A linearidade foi determinada

 Cattaneo, R./Revista Brasileira de Toxicologia 19, n.1 (2006)27 através do cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados, e expressa pelo coeficiente de correlação (r2). A exatidão foi calculada a partir da diferença entre o valor real presente em amostras de urina branco adicionadas

com três níveis de concentração de cotinina (50 ng/mL, 500 ng/mL e 1000 ng/mL) e o valor obtido na análise. A exatidão foi avaliada através da inexatidão ou bias (viés ou tendenciosidade), ou seja, o afastamento entre os valores esperados e aqueles obtidos. A aplicabilidade do método foi avaliada por meio

da análise de cerca de 20 amostras reais de fumantes e de indivíduos não expostos ou com exposição ambiental. Este projeto foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande de Sul.

Resultados

Conforme a Figura 1, na qual é apresentado o cromatograma de uma amostra branco adicionada de padrão

de cotinina, o tempo de retenção da cotinina foi em torno de 6 minutos e o do padrão interno de 5 minutos.

Na Tabela 1 são apresentados os resultados de precisão, exatidão e estabilidade para os pontos 50, 500 e

1000 ng/mL. O limite de detecção do método foi 5ng/mL e o de quantificação foi 10ng/mL. A linearidade está ilustrada na Figura 2. O coeficiente de correlação linear encontrado foi r 2= 0,9979 no intervalo de 10 a 1000 ng/mL. A aplicação das condições cromatográficas descritas a amostras reais resultou nos cromatogramas apresentados nas Figuras 3 e 4, as quais representam, respectivamente, uma amostra de indivíduo não exposto à nicotina e uma amostra de indivíduo fumante.

Fonte: http://www.sbtox.org.br/Revista_SBTox/V19[1]2006/V19%20n1_Pag%2025-31.pdf

Araujo AJ, Menezes AMB, Dorea AJPS, et al. Diretrizes para Cessação do Tabagismo. J Bras Pneumol 2004; 30:S1-S76./Ceppa F, El Jahiri Y, Mayaudon H, Dupuy O, Burnat P. High-performance liquid chromatographic determination of cotinine in urine in isocratic mode. J Chromatogr B Biomed.Appl 2000; 746:115-122.

 

Postado por Luma Mendes

Método Analítico Por CLAE Em Comprimidos de Benznidazol.

    

DEVELOPMENT OF AN HPLC ANALYTICAL METHOD FOR BENZNIDAZOL TABLETS

      

       O trabalho pelo qual a pesquisa foi extraída, "tem como objetivo o desenvolvimento e validação de método analítico para doseamento de comprimidos à base de benznidazol, de acordo com a RE 899 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)".

         A amostra de comprimidos testada foi diluída em metanol Merck® até uma concentração final de 40 mg L-1, sendo a varredura programada em uma faixa entre 200 a 800 nm, objetivando em confirmar o comprimento de absorvância máximo citado pela literatura. Visando redução de custo e de tempo de análise, realizou-se estudo em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

         As amostras foram preparadas com a primeira diluição em acetonitrila, o que se justifica pela hidrofobicidade do ativo e a segunda diluição em fase móvel, opção testada visando a redução de custo para a análise. O cromatograma obtido registrou o pico desta análise simétrico, que se apresenta com tempo de retenção curto, excelente para rotina industrial, agilizando a liberação do produto, principalmente durante o processo de fabricação. 

A partir do trabalho realizado tem-se que, pelos resultados apresentados, o método desenvolvido apresenta-se validado conforme a RE nº 899 da ANVISA, estando disponível como método específico, preciso, exato e robusto para acompanhamento do estudo de estabilidade nos moldes acelerado e de longa duração dos comprimidos de benznidazol 100 mg, desenvolvidos pelo LAFEPE® em parceria com a Roche®. Este medicamento é hoje considerado a única alternativa mundial para o tratamento de pacientes crônicos com doença de Chagas.

Fonte: SILVA; A. L. M.; et al.Desenvolvimento De Método Analítico Por CLAE  Em Comprimidos De Benznidazol Para A Doença De Chagas. Quim. Nova, Vol. 30, No. 5, 1163-1166, 2007. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/qn/v30n5/a21v30n5.pdf> Acessado em: 20 abr. 2014

Postado por: Ana Brígida

Determinação De Lamivudina, Estavudina E Nevirapina, Em Comprimidos, Por Cromatografia Líquida De Alta Eficiência

Determination Of Lamivudine, Stavudine And Nevirapine In Tablets By High Performance Liquid Chromatography

    A estavudina (d4T) e a lamivudina (3TC), fármacos ITRN, são, preferencialmente, recomendados para comporem a terapia anti-retroviral. Um dos principais motivos que levam à diminuição da adesão ao tratamento, pelos pacientes portadores do HIV, é a alta complexidade do regime terapêutico, com a administração diária de grande número de comprimidos e cápsulas, utilizados por tempo indeterminado. 

      Foi utilizado o cromatógrafo a líquido de alta eficiência HP 1100, equipado com bomba quaternária,  forno de coluna, auto-injetor HP 1100, detector UV-Vis DAD HP 1100. Os dados cromatográficos foram analisados usando-se o programa HP ChemStation. As soluções utilizadas foram: Solução padrão estoque, Solução padrão diluída, Solução amostra e Solução placebo.

Na Figura 2 está apresentado o cromatograma obtido com as condições estabelecidas. Observou-se a completa separação entre 3TC, d4T e NVP, mesmo na presença dos excipientes do placebo. O cromatograma do placebo apresentou picos com tempo de retenção próximos de 2,5 min, mas com intensidades muito baixas, não constituindo interferência em potencial. 

       Calcularam-se os teores dos ARV nos comprimidos a cada parâmetro modificado. Estes teores  não apresentaram variações significativas em relação aos teores obtidos aplicando-se o métodonas condições estabelecidas.alcularam-se os valores de resolução, que foram superiores a 2, indicando adequada separação dos picos, e os valores de fator de cauda, que ficaram próximos da unidade, indicando simetria dos picos. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que o método é robusto. 

        Um método por cromatografia líquida de alta eficiência para determinação de lamivudina, estavudina e nevirapina, em comprimidos foi desenvolvido e validado. O método, em fase reversa e modo isocrático, demonstrou ser seletivo, linear, preciso, exato erobusto, além de simples e rápido, podendo ser aplicado a análises rotineiras de controle de qualidade.

Referência: SILVA, G. R.; et al. Determinação De Lamivudina, Estavudina E Nevirapina, Em Comprimidos, Por Cromatografia Líquida De Alta Eficiência. Quim. Nova,Vol. 29, No. 6, 1159-1163, 2006.  Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/qn/v29n6/01.pdf>. Acesso em: 15 abr. 2014

Postado por Sterffson Jota