DICAS E CUIDADOS COM AS FASES MÓVEIS

                                      TIPS AND CARES FOR MOBILE PHASES         

• A fase móvel deve ser de alta pureza, como um solvente de grau cromatográfico, permitindo realizar análises de alta sensibilidade com detectores por fluorescência ou por absorbância no ultravioleta, onde as impurezas da fase móvel podem absorver e diminuir a sensibilidade do detector para os componentes da amostra.

• Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase móvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto, satura-se a fase móvel com a fase estacionaria utilizando-se para isso uma pré-coluna contendo uma alta concentrado da mesma fase estacionaria. 

•  No preparo da fase móvel deve-se filtrar o solvente (trabalhar com filtro Millipore) e desgaseificá-lo. Deixar o solvente no frasco dentro de banho ultra-som por, no mínimo, 15 minutos. Esse tempo varia conforme a solução a ser preparada. No caso de solvente orgânico com água, esse tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de água e álcool, que é exotérmica, deve-se efetuar a mistura e depois desgaseificá-la. Em mistura de acetonitrila e água acetonotrila.

• Ao se trabalhar com água, tomar todos os cuidados para que não se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre o sistema abundantemente e passar um agente de esterilização (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para análise de açúcares utilizar água ligeiramente acidificada.

• O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com solução tampão. Nesse caso uma atenção a mais deve ser dada. Não deixar o sistema parado quando se trabalha com tampão, pois pode cristalizar sal na região do pistão da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pistão.

 Fonte: 

COLLINS, C. H. & GUIMARÃES, L. F. L., Cromatografia líquida de alta eficiência. In: Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introdução a Métodos Cromatográficos, 3. ed., Ed. UNICAMP, São Paulo, 1988, p 179 - 243.

CIOLA, R., Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, , ed. Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 1998

Postado por Sterffson Jota

3 Passos importantes na realização da CLAE (2/3)

  2. Como otimizar as condições cromatográficas

 (proporção dos componentes da fase móvel e comprimento de onda).

Optimizing chromatographic conditions (the proportion of the components of the mobile phase and wavelength).

Proporção dos componentes:

A medida que modificamos a proporção de reagentes na fase móvel modificamos a polaridade dessa fase assim alteramos o tempo de análise, por exemplo no caso da cafeína a medida que mudamos a proporção de 35:65 para 40:60 diminuímos o tempo de análise de 8,221 minutos para 6,717 minutos essa foi uma forma de otimizar a análise.

Comprimento de onda:

Para otimizar as condições cromatográficas em relação ao comprimento de onda, devemos trabalhar no comprimento de onda máximo como é indicado na lei de Beer que no caso da cafeína é de 272nm, porém trabalhamos no comprimento de onda de 254 nm e obtivemos um erro positivo em relação a lei de Beer, o erro foi razoavelmente baixo, devido podermos trabalhar em uma faixa de comprimentos de onda máximo, tanto em relação a área quanto em relação ao tempo, mas o correto para se otimizar uma determinada substância é utilizar o comprimento de onda máximo.

 

Fontes: 

1.Collins. C. H., Braga G. L., Bonato P. S. ; Fundamentos de cromatografia, Ed. Unicamp, 2007.

2. Skoog, West, Holler; Fundamentos de Química Analítica, Ed. Thomson , 8°Ed.

  Postado por Sterffson Jota

Determinação do teor de omeprazol por cromatografia líquida de alta eficiência em matérias-primas e produtos acabados.

Determination of omeprazole by high performance liquid chromatography efficiency in raw materials and finished products.

Omeprazol, derivado benzimidazólico, é o primeiro da classe de fármacos conhecidos como inibidores da bomba de prótons, e tem se mostrado bastante eficaz em promover potente inibição da secreção gástrica do ácido clorídrico. Deste modo é, utilizado principalmente, no tratamento de úlceras gastrointestinais, refluxo esofágicos e na síndrome de Zollinger-Ellison. É uma substância de caráter lipofílico, e comporta-se como uma base fraca, com pKa 1 = 4,2 e pKa2 = 9,0 (CASTRO et al., 1999). Verificou-se que a potência do omeprazol é muito aumentada em meio ácido, provavemente devido a uma alteração na estrutura da bomba protônica da célula parietal, tornando-a mais susceptível aos efeitos do omeprazol em pH baixo, (SILVA, 2002).

O método foi utilizado para determinar o teor de omeprazol nas matérias-primas e produtos acabados foi descrito pela Farmacopéia Americana (USP-24, 2001). 

A quantificação do teor de omeprazol foi realizado em cromatógrafo líquido Varian modelo Prostar, acoplado com detector UV, software Varian Star Workstation versão 5.0 foi usado para registrar os cromatogramas e medir as áreas de picos. Utilizou-se uma coluna Microsorb-MV100 C8. A cromatografia foi realizada à temperatura 25 °C. A eluição foi realizada com acetonitrila /tampão fosfato de sódio pH 7,6 na proporção de 3:1(v/v) num fluxo de 1ml/min.

Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que 48% das matérias-primas estavam em desacordo com a especificação farmacopeica. Estes resultados permitem sugerir a necessidade de uma melhor qualificação dos fornecedores, além disso, um maior rigor durante o armazenamento dessas matérias-primas nas farmácias, prevenindo da absorção de umidade ou degradação do fármaco. 

Os resultados relativos à análise das cápsulas mostraram que 29% das amostras estavam em desacordo com a especificação farmacopeica (USP-28, 2005), que permite uma variação de 90 à 110% sobre o teor de omeprazol. A qualidade das matérias-primas pode ter influenciado neste resultado, além disso, pode-se sugerir uma revisão nos procedimentos de produção das cápsulas, visando detectar falhas, durante a pesagem, homogeneização e encapsulamento do pó. A técnica CLAE mostrou-se simples, rápida e adequada para quantificação do teor de omeprazol, resultando em picos de boa resolução.

Fonte: www.revistas.ufg.br/index.php/REF/article/viewFile/2016/1983

Revista Eletrônica de Farmácia Suplemento Vol 2 (2), 206-209, 2005.

Postado por Glaycianne Alves

Determinação de cafeína em bebidas através de cromatografia líquida de alta eficiência(CLAE).

Determination of caffeine in beverages by high performance liquid chromatography(HPLC)

A cafeína é alcalóide encontrado em uma grande variedade de bebidas (café, chás, refrigerantes...). Quando ingerida atua como diurética e como estimulante dos sistemas nervoso central e cardiovascular. Devido suas propriedades estimulantes também é bastante utilizada como "doping" por atletas. Pela sua popularidade, a cafeína tem sido uma droga largamente consumida e o seu papel na saúde humana tem recebido uma considerável atenção nas últimas décadas.

Cafeína (1,3,7-Trimetilxantina)

Devido à complexidade e variedade de substâncias contidas nos alimentos, torna-se necessária a separação da cafeína antes da sua quantificação e uma das técnicas utilizadas é a CLAE. O procedimento é rápido, simples e exato. Para cada tipo de bebida, faz-se um procedimento.

No caso do refrigerante, o líquido é filtrado e desgaseificado, sob vácuo e sonicação. Em seguida injeta-se uma quantidade da amostra diretamente no CLAE.

Nos chás, faz-se uma infusão com água por 3 minutos e quantidades variáveis de massa. No café foram adotados diferentes procedimentos de preparo de acordo com o tipo de café.

A metodologia proposta é adequada para a quantificação de cafeína em bebidas. As principais vantagens do método são a simplicidade, as amostras não precisam de pré-tratamento; a rapidez, ocorre uma boa separação em um intervalo de tempo curto.

Fonte: quimicanova.sbq.org.br/qn/qnol/1995/vol18n4/v18_n4_10.pdf‎
                                                       
Postado por Glaycianne Alves

Análise de vitamina C em alimentos por cromatografia líquida de alta eficiência.

 Analysis of vitamin C in foods by high performance liquid chromatography

       A determinação do ácido ascórbico em alimentos é bastante complexa em
função dos baixos níveis em que este pode ser encontrado, além da presença de
substâncias interferentes da matriz estudada que podem, inclusive, contribuir para
a sua degradação. 

     A utilização de uma coluna de troca iônica torna a determinação de  vitamina C
bastante seletiva em função da combinação de técnicas que este tipo de coluna 
permite, pois na verdade o mecanismo de separação nesta coluna consiste
basicamente de exclusão iônica e partição por fase reversa.

      As soluções padrão foram preparadas e injetadas no sistema cromatográfico 
imediatamente após o preparo para evitar possíveis problemas de degradação da
vitamina C com o tempo, embora estudos prévios tenham verificado que em 
aproximadamente 2 horas de espera no injetor automático, não houve mudança na
resposta da solução padrão de ácido ascórbico.

 

             

     Os perfis cromatográficos obtidos, aliados aos dados de espectro UV, incluindo a 
ferramenta de pureza espectral, permitiram concluir que o método ofereceu excelente
seletividade e  separação para a vitamina C presente nas amostras testadas.

    Os testes que avaliaram a estabilização da vitamina C levam à conclusão 
de que o uso de fase móvel (solução de ácido sulfúrico suprapuro ® (0,05 M),
além de conferir maior rapidez ao método, não produz perdas de vitamina C.
    Diante dos resultados obtidos pode-se afirmar que o método proposto
neste estudo é bastante vantajoso para a análise de vitamina C em matrizes
vegetais.

 

FONTE: ROSA. J.S. et al. Desenvolvimento de um método de análise de vitamina C em alimentospor 

cromatografia líquida de alta eficiência e exclusão iônicaCiênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 

27(4): 837-846, out.-dez. 2007 Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/cta/v27n4/25.pdf. Acesso em: 07 abr. 

2014

Postado por Sterffson Jota

Análise de ácido clorogênico obtido pela CLAE/Analysis chlorogenic acid obtained by HPLC.

O termo ácido clorogênico (ACG) parece ter sido introduzido em 1846 por Payen

para designar um composto fenólico com função ácida, de estrutura ainda desconhecida, que conferia cor verde ao meio aquoso quando em meio levemente alcalino e exposto ao ar.  

Esse ácido foi isolado em em 1907 na forma de um complexo cristalino, denominado clorogenato de cafeína, a partir do qual se preparou um ácido puro.

O grupo mais abundante de ACG na natureza é o ACQ

A partir da metade da década de 70, com a introdução da CLAE, houve um grande avanço na análise de isômeros individuais de ACG em extratos vegetais. 

Usaram a CLAE para a análise de alguns isômeros de ACQ em amostras de café. A coluna do tipo fase reserva (apolar) consistiu de sílica. Essa fase estacionária confere apolaridade ao suporte, porém como a ligação química não ocorre em toda a sua extensão, uma quantidade razoável de sítios sinalol permanece inalterada.

Os maiores inconvenientes desse método foram a necessidade de duas corridas cromatográficas, o número baixo de pratos da coluna devido ao tamanho da partícula do suporte  e o uso de uma bomba de pressão constante, que não compensa as variações de vazão da fase móvel.

Com o desenvolvimento de fases estacionárias contendo micropartículas, houve um grande avanço na análise de ACG pela CLAE. Esse tipo de fase estacionária permitiu a separação completa de todos os isômeros do ACG.

Fonte: http://www.scielo.br/pdf/qn/v27n4/20800.pdf

Postado por Glaycianne Alves

CARACTERÍSTICAS DAS FASES ESTACIONÁRIAS EM CLAE

                      CARACTERÍSTICAS DAS FASES ESTACIONÁRIAS EM CLAE / CHARACTERISTICS OF STATIONARY PHASES IN HPLC

Considerando as suas propriedades físicas, os recheios para CLAE podem ser classificados de acordo com os seguintes aspectos:

a) Sólidos rígidos, semi-rígidos ou não rígidos;
b) Partículas porosas ou peliculares;
c) Partículas esféricas ou irregulares;
d) Partículas com diferentes diâmetros.

Sólidos rígidos a base de sílica são os recheios mais usados atualmente. Esses recheios podem resistir a pressões relativamente altas, resultando em enchimento estável e colunas eficientes de partículas pequenas.

Sólidos semi-rígidos são geralmente constituídos de partículas porosas de poliestireno entrecruzadas com divinilbenzeno. 0 semi-rígido tem sido usado para pressões até 350 bars. O maior interesse no semi-rígido atualmente é para aplicações na CLAE por exclusão com fase móvel orgânica; contudo eles também são usados na troca iônica.

 Sólidos não rígidos, tais como agarose ou dextrose, usados em cromatografia por exclusão, são aplicados exclusivamente para a separação de moléculas grandes, solúveis em água, como as proteínas. Contudo, estes sólidos não rígidos não podem resistir as pressões usadas na CLAE. Ambos podem ser introduzidos na coluna com certa facilidade, obtendo-se colunas muito eficazes. Elas podem ser utilizadas em cromatografia líquido-sólido, dependendo da atividade da sua superfície ou pode ser recoberto com alguma fase líquida e obter-se uma coluna para CLAE com fase quimicamente ligada.

Postado por Sterffson Jota

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Aplicada ao Estudo dos POE.

Poluentes orgânicos emergentes (POE) ou simplesmente contaminantes emergentes referem-se a qualquer composto químico presente numa variedade de produtos comerciais como medicamentos, produtos de uso veterinário, embalagens de alimentos, produtos de higiene, agrotóxicos, etc, ou ainda qualquer micro-organismo, que podem ser encontrados em matrizes ambientais e biológicas, que não são usualmente monitorados ou que ainda não possuem legislação regulatória correspondente, mas que apresentam risco potencial à saúde humana e ao meio ambiente.

As separações em química ambiental geralmente envolvem as duas técnicas cromatográficas mais conhecidas: a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high performance liquid chromatography) e a cromatografia gasosa (GC, gas chromatography).

Diagramas de polaridade-volatilidade podem esquematizar de forma didática qual a técnica de separação a ser utilizada, dividindo os poluentes orgânicos de acordo com suas propriedades físico-químicas de volatilidade e polaridade. Esta figura pode ser interpretada da seguinte forma: poluentes voláteis e semivoláteis, não polares/lipofílicos são frequentemente separados por cromatografia gasosa. As separações por cromatografia gasosa podem utilizar detectores universais como detector de ionização por chama (FID, flame ionization detector) ou ainda detectores de maior detectabilidade e seletividade, como o detector por captura de elétrons (ECD, electron capture detector) ou detector de nitrogênio e fósforo (NPD, nitrogen-phosphorus detector). A detecção utilizando espectrômetro de massas (MSD, mass selective detector) e ionização por impacto de elétrons tornou-se a mais utilizada, devido aos excelentes limites de detecção e às possibilidades de utilização de softwares de tratamento de dados com bibliotecas contendo milhares de espectros de massas para confirmação das estruturas dos compostos analisados. Este vem sendo o detector mais utilizado para determinação de poluentes orgânicos voláteis ou semivoláteis por GC.

Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422011000400020&script=sci_arttext 

/Cromatografia Líquida de alta eficiência para estudos de poluentes orgânicos emergentes

Acesso em: 29 me Março de 2014

Postado por Luma Mendes

Cromatografia líquida clássica x CLAE/ Classical liquid chromatography X HPLC 

Na cromatografia líquida clássica (CLC) o recheio da coluna é utilizado geralmente uma só vez, porque parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível. O enchimento da coluna deve ser repetido para cada separação. A aplicação da amostra, para ser feita corretamente, requer alguma habilidade, fatos que representam um desperdício de material e tempo. A vazão de eluente na CLC é promovida pela ação da gravidade e as frações individuais da amostra são coletadas manualmente ou através de um coletor de frações. As separações requerem, geralmente, várias horas e a detecção e a quantificação das frações são realizadas por análise manual. 

Na CLAE emprega-se um coluna fechada, reaproveitável; portanto, até centenas de separações individuais podem ser realizadas com a mesma coluna. Essas colunas são muito eficazes, mas oferecem uma grande resistência à vazão da fase móvel, ou seja, ela sofre uma perda de carga. Por esta razão é necessário empregar sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) que fazem a fase móvel migrar a uma velocidade razoável através da coluna. A vazão da fase móvel é controlada facilmente, resultando em operações mais reprodutíveis, que tornam as análises executadas por CLAE mais precisas. Vários tipos de detectores, que podem ser colocados na saída da coluna, proporcionam uma identificação e quantificação continua dos componentes da amostra. A análise quantitativa pela CLAE pode atingir uma precisão superior a + 0.5%. Finalmente, separações em escala preparativa de miligramas de amostras são relativamente fáceis.

Fonte: http://www.ufjf.br/baccan/files/2010/10/Aula-10-Cromatografia-liquida-Modo-de-Compatibilidade.pdf Acesso em 25/03/2014.

Mais informações: http://www.cromatografialiquida.com.br/  

Postado por Glaycianne Alves

Princípios Da Cromatografia Líquida / Principles for Liquid Chromatography.

     A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem sido a técnica analítica de separação mais utilizada atualmente, se trata de um método altamente sensível para determinações quantitativas. Esse método é adequado para separações de espécies termicamente frágeis e espécies não-voláteis é utilizado para análise de diversas substâncias podendo assim ser de interesse para a indústria, medicina, ciência, entre outros.  É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis. Dentre suas aplicações, pode-se citar o controle de qualidade de fármacos e radiofármacos e aplicações específicas na área da pesquisa.

 Sistema de cromatografia líquida
Fonte:  http://www.directindustry.es/prod/shimadzu-europe/cromatografos-liquidos-alta-eficacia-hplc-25210-56987.html

Os materiais que podem ser analisados por este método são diversos, entre eles estão: proteínas, ácidos nucléicos, hidrocarbonetos, drogas, pesticidas, antibióticos e várias substâncias inorgânicas.

              Vantagens                             Limitações

                  Menor tempo de análise               Alto custo da instrumentação

                  Alta resolução                             Alto custo da operação

                  Resultados quantitativos              Pouco usada para análise qualitativa 

                  Boa sensibilidade                        Falta de detector universal sensível

                  Versatilidade e automação           Necessidade de experiência no manuseio

Fontes: ALBERT EINSTEIN - http://www.einstein.br/Ensino/cursos-de-atualizacao/Paginas/curso-de-atualizacao-em-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia-clae.aspx

 PORTAL EDUCAÇÃO - http://www.portaleducacao.com.br/farmacia/artigos/28657/cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia-clae

Postado por: Ana Brígida

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE)/High Performance Liquid Chromatography(HPLC

A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE ou HPLC) se desenvolveu muito nos últimos anos, recebendo o nome de cromatografia líquida porque a sua fase móvel é um solvente. A principal característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química entre ambas.

Os componentes de um cromatógrafo líquido são: bomba, coluna cromatográfica, detector e o registrador. É um método utilizado para separação de espécies iônicas ou macromoléculas e compostos termolábeis. 

A CLAE separa e detecta amostras em temperatura ambiente. Por essa razão, agências como United States Food and Drug Administration (FDA) adotaram e recomendaram esse método para análises de compostos não voláteis, de alta polaridade e termicamente estáveis. 

Esquema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Fonte: http://www.biomedicinabrasil.com/2012/10/metodos-cromatograficos.html

Fonte: Cromatografia Líquida De Alta Eficiência - PFARMA http://pfarma.com.br/farmaceutico-industrial/130-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia.html#ixzz2wAZKefzn



Postado por Glaycianne Alves