De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde, o consumo de tabaco representa a segunda maior causa de mortes no mundo, ocorrendo 5 milhões de óbitospor ano em decorrência deste hábito, correspondendo a cerca de 6 mortes por segundo (ARAUJO et al., 2004; WHO, 2006). Tendo em vista os danos à saúde que esta dependência causa, é crescente a demanda por análises laboratoriais que permitam avaliar a exposição ao tabaco, principalmente em pacientes em tratamento para cessar de fumar ou em indivíduos com suspeita de exposição ambiental à fumaça de cigarro, entre eles crianças e gestantes. Estas análises também são aplicáveis a trabalhadores envolvidos com o cultivo do tabaco, uma vez que pode ocorrer absorção de nicotina via dérmica (DOCTOR et al., 2004).
A cotinina pode ser determinada por diversos métodos, entre eles espectrofotometria, imunoensaios, cromatografia gasosa (CG), cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) e CG ou CLAE acoplada à
espectrometria de massas (WATTS et al., 1990; HAUFROID & LISON, 1998; SHIN et al., 2002; DHAR, 2004; KIM et al.,2005).Considerando a melhor relação custo e benefício foi objetivo deste trabalho validar um método por CLAE precedida por extração líquido-líquido para mensurar os níveis de cotinina na urina com a finalidade de monitorar a exposição ao tabaco, incluindo exposição ambiental.
Parâmetros cromatográficos
A separação cromatográfica foi realizada em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) Agilent
1100 SERIES (USA), equipado com detector ultravioleta (comprimento de onda de 260 nm), loop de 20µL e coluna Zorbax Eclipse XDB-C8 (4,6mm x 150mm x 5µm Agilent ®). Como fase móvel foi utilizada água Milli-Q:metanol:acetato de sódio 0,1M:acetonitrila (50:15:25:10,v/v) contendo 1 mL de ácido cítrico 0,034M e 5,0mL de trietilamina para cada litro de solução. O pH foi ajustado a 4,4 com ácido acético.
A fase móvel, o comprimento de onda do detector, o tipo de coluna e o volume de extrato injetado foram selecionados através da realização de testes com parâmetros citados por vários autores (CEPPA et al., 2000; GHOSHEH et al., 2000; NAKAJIMA et al., 2000; PAGE-SHARP et al., 2003; HEAVNER et al., 2005).
Procedimento de extração
Para a realização das análises, foram pipetados 2,0 mL de urina centrifugada. Posteriormente foi adicionado 25µL de hidróxido de sódio 10M, 100µL de padrão interno (2-fenilimidazol 1,0µg/mL) e 4,0 mL de diclorometano. A seguir esta solução foi agitada por 40 minutos em homogeneizador e centrifugada por 10 minutos a 3000 rpm. Dois mililitros da fase orgânica foram transferidos para um
frasco evaporador e colocados em termobloco (Pierce®,modelo 18940), sob corrente de nitrogênio e temperatura ambiente, até secura. Posteriormente o resíduo foi reconstituído com 200µL de fase móvel e injetado em CLAE.
Validação analítica
Para a validação do método, foram seguidas as recomendações preconizadas por CHASIN e colaboradores (1998). A linearidade foi determinada pela análise dos calibradores (em triplicata) preparados no próprio laboratório utilizando urina de indivíduos não expostos ao tabaco, com os quais se criou uma curva de calibração com as concentrações de 10,0; 25,0; 50,0; 100,0; 250,0; 500,0 e 1000,0 ng/mL, abrangendo a faixa de interesse do trabalho (SHIN et al., 2002). A linearidade foi determinada
Cattaneo, R./Revista Brasileira de Toxicologia 19, n.1 (2006)27 através do cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados, e expressa pelo coeficiente de correlação (r2). A exatidão foi calculada a partir da diferença entre o valor real presente em amostras de urina branco adicionadas
com três níveis de concentração de cotinina (50 ng/mL, 500 ng/mL e 1000 ng/mL) e o valor obtido na análise. A exatidão foi avaliada através da inexatidão ou bias (viés ou tendenciosidade), ou seja, o afastamento entre os valores esperados e aqueles obtidos. A aplicabilidade do método foi avaliada por meio
da análise de cerca de 20 amostras reais de fumantes e de indivíduos não expostos ou com exposição ambiental. Este projeto foi aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande de Sul.
Resultados
Conforme a Figura 1, na qual é apresentado o cromatograma de uma amostra branco adicionada de padrão
de cotinina, o tempo de retenção da cotinina foi em torno de 6 minutos e o do padrão interno de 5 minutos.
Na Tabela 1 são apresentados os resultados de precisão, exatidão e estabilidade para os pontos 50, 500 e
1000 ng/mL. O limite de detecção do método foi 5ng/mL e o de quantificação foi 10ng/mL. A linearidade está ilustrada na Figura 2. O coeficiente de correlação linear encontrado foi r 2= 0,9979 no intervalo de 10 a 1000 ng/mL. A aplicação das condições cromatográficas descritas a amostras reais resultou nos cromatogramas apresentados nas Figuras 3 e 4, as quais representam, respectivamente, uma amostra de indivíduo não exposto à nicotina e uma amostra de indivíduo fumante.
Fonte: http://www.sbtox.org.br/Revista_SBTox/V19[1]2006/V19%20n1_Pag%2025-31.pdf
Araujo AJ, Menezes AMB, Dorea AJPS, et al. Diretrizes para Cessação do Tabagismo. J Bras Pneumol 2004; 30:S1-S76./Ceppa F, El Jahiri Y, Mayaudon H, Dupuy O, Burnat P. High-performance liquid chromatographic determination of cotinine in urine in isocratic mode. J Chromatogr B Biomed.Appl 2000; 746:115-122.
Postado por Luma Mendes
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