Válvulas para amostragem

Anteriormente, a introdução da amostra era efetuada de forma similar a realizada na
cromatografia gasosa , ou seja, mediante micro-seringa que injeta a amostra dentro de
uma pequena câmara, de onde é eluída pela fase móvel. Os equipamentos modernos
empregam válvulas para amostragem, como a ilustrada esquematicamente na figura abaixo.
A amostra introduzida na válvula mediante a seringa, deve encher o espaço interno da
porção do tubo capilar de aço, a alça de amostragem (carga). Normalmente o volume
contigo na alça é de 1 a 100 uL. A amostra é injetada na coluna, ao girar a válvula para
que a posição de entrada e saída mude (injeção na coluna). Desta forma pode injetar-se
na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de amostra, dependendo do tubo
capilar (alça de amostragem) utilizado, com um alto grau de reprodutibilidade. As válvulas
para amostragem são fabricadas somente de material inerte, como teflon e aço inoxidável, e seu desenho é tal que resistem a pressões muito elevadas.

Valvula de amostragem para CLAE. Posição de carregar e posição de injeção.

Postado por Alana de Jesus

29/05/2014 - Quinta-feira

3º Semestre Farmácia 

Informes gerais sobre equipamentos de CLAE

Informes gerais sobre equipamentos de CLAE

•   O grande avanço na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade.

•    As fases móveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso.

•   A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta produtibilidade, possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado.

•    As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna.

•    O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de indíce de refração, e eletroquímicos, entre outros.

• O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um microcomputador.

Fonte: DEGANI, A. L; CASS, Q. B; VIEIRA, P. C; Cromatografia: Um Breve Ensaio. Química Nova na Escola. N° 7. Maio 1998.

Postado por Sterffson Jota

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)

Fonte: http://www.crq4.org.br/sms/files/file/hplc_araraquara_2012_site.pdf/ Princípios da Cromatografia Líquida

Postado por Luma Mendes

Pré-colunas + Forno

Pré-colunas 

Aumento da vida das colunas

• Mesma composição da fase estacionária / maior granulometria.
• Remoção de partículas e contaminantes dos solventes.
• Saturação das fase móvel com a fase estacionária.

Forno de colunas

TA - 150 C (Temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - maioria das aplicações)

• Maior a temperatura menores os tempos de retenção
• Maiores temperaturas causam maior degradação da coluna

Para maior qualificação a termostatização é essencial (+-0,1 C)

• A identificação é essencialmente feita com base nos tempos de retensão.

Postado por Alana de Jesus.

23/05/2014 - Sexta-Feira

3º Semestre - Farmácia.

Análise Teórica Comparativa de CLC X CLAE

Comparação teórica de Cromatografia líquida clássica (CLC) x Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

Theoretical Comparison of Classical liquid chromatography (CLC) x High performance liquid chromatography (HPLC)

Na Cromatografia Líquida Clássica (CLC):

      O recheio da coluna é utilizado geralmente uma só vez, porque parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível. O enchimento da coluna deve ser repetido para cada separação. A aplicação da amostra, para ser feita corretamente, requer alguma habilidade, fatos que representam um desperdício de material e tempo. A vazão de eluente na CLC é promovida pela ação da gravidade e as frações individuais da amostra são coletadas manualmente ou através de um coletor de frações. As separações requerem, geralmente, várias horas e a detecção e a quantificação das frações são realizadas por análise manual.

 Na CLAE:  

          Emprega-se um coluna fechada, reaproveitável; portanto, até centenas de separações individuais podem ser realizadas com a mesma coluna. Essas colunas são muito eficazes, mas oferecem uma grande resistência à vazão da fase móvel, ou seja, ela sofre uma perda de carga. Por esta razão é necessário empregar sistemas de bomba de alta pressão (até 400 bars) que fazem a fase móvel migrar a uma velocidade razoável através da coluna. A vazão da fase móvel é controlada facilmente, resultando em operações mais reprodutíveis, que tornam as análises executadas por CLAE mais precisas. Vários tipos de detectores, que podem ser colocados na saída da coluna, proporcionam uma identificação e quantificação continua dos componentes da amostra. A análise quantitativa pela CLAE pode atingir uma precisão superior a + 0.5%. Finalmente, separações em escala preparativa de miligramas de amostras são relativamente fáceis.

Fonte: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Disponível em:< http://www.ebah.com.br/content/ABAAAeqmMAH/clae-cromatografia-liquida-alta-eficiencia>. Acesso em: 21 maio 2014.

Postado por Sterffson Jota

Tipos de Interações entre Moléculas do Solvente e Analito.

POLARIDADE DA FASE MÓVEL

 Quatro tipos de interações entre moléculas do solvente e analito devem ser consideradas:

 Types of interactions between molecules of the solvent and analyte.

a) Dispersão: As interações de dispersão ocorrem porque os elétrons estão em movimento caótico e em certos momentos podem assumir uma configuração assimétrica. Em um determinado instante pode-se criar um momento dipolar temporário numa molécula, polarizando os elétrons de um lado de uma molécula adjacente, repelindo-os consequentemente. Esse dipolo resultante acarretará numa atração eletrostática dessas moléculas. As interações de dispersão são maiores para as moléculas mais fáceis de polarizar. 

b) Interação dielétrica: É a interação dos íons da amostra com os líquidos de alta constante dielétrica. A carga polariza as moléculas do solvente que as rodeia, resultando numa atração eletrostática da substância com o solvente. Ela facilita a dissolução de substâncias iônicas e ionizáveis da amostra em fases polares como a água, metanol, etc.

c) Dipolos: Ocorrem quando existem moléculas de solventes e analitos que têm dipolos permanentes. Ocorrem geralmente entre grupos funcionais das próprias moléculas.

Fonte: CIOLA, R., Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, , ed. Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 1998

Postado por Ana Brígida

Tratamento de amostras

Tratamento de amostras

Amostras puras

• Apenas necessitam do solvente apropriado (solubilização seguido de filtração).

- O solvente deverá ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase movel.

- Usar THF ou metanol em fase reversa (água) pode provocar perdas de resolução.

- A escolha do solvente pode ser condicionada pelo o detector utilizado.

Amostras compostas

• A presença de impurezas não dissolvidas exige no minimo uma filtração.
• Extração da matrix (excipientes).

- Necessidade de determinar a% de recuperação.

• Uso de solventes diferentes do usado na injecção exige reconstituição da amostra. 

- Extração/ reconstituição/ concentração.

• Pré colunas/ separação de componente de diferentes polaridades (sep-pak)

Amostra biológicas

• Caracterizadas por concentrações muito baixas
• Precipitação das proteinas ( acetonitrilo + centrifugação) /concentração / reconstituição.

   

Postado por Alana de Jesus.

15/05/2014 - Quinta-feira.

3º Semestre - Farmácia.

DICAS E CUIDADOS COM AS FASES MÓVEIS

                                      TIPS AND CARES FOR MOBILE PHASES         

• A fase móvel deve ser de alta pureza, como um solvente de grau cromatográfico, permitindo realizar análises de alta sensibilidade com detectores por fluorescência ou por absorbância no ultravioleta, onde as impurezas da fase móvel podem absorver e diminuir a sensibilidade do detector para os componentes da amostra.

• Quando se utilizar cromatografia líquido-líquido, a fase móvel pode dissolver a fase estacionaria. Para evitar isto, satura-se a fase móvel com a fase estacionaria utilizando-se para isso uma pré-coluna contendo uma alta concentrado da mesma fase estacionaria. 

•  No preparo da fase móvel deve-se filtrar o solvente (trabalhar com filtro Millipore) e desgaseificá-lo. Deixar o solvente no frasco dentro de banho ultra-som por, no mínimo, 15 minutos. Esse tempo varia conforme a solução a ser preparada. No caso de solvente orgânico com água, esse tempo pode ser maior. Por exemplo, em uma mistura de água e álcool, que é exotérmica, deve-se efetuar a mistura e depois desgaseificá-la. Em mistura de acetonitrila e água acetonotrila.

• Ao se trabalhar com água, tomar todos os cuidados para que não se forme fungo dentro da coluna. Lavar sempre o sistema abundantemente e passar um agente de esterilização (por ex, MeOH ou Acetonitrila). Para análise de açúcares utilizar água ligeiramente acidificada.

• O mesmo cuidado se deve ter quando se trabalha com solução tampão. Nesse caso uma atenção a mais deve ser dada. Não deixar o sistema parado quando se trabalha com tampão, pois pode cristalizar sal na região do pistão da bomba. Ao se reiniciar o trabalho, esse sal cristalizado pode danificar o corpo do pistão.

 Fonte: 

COLLINS, C. H. & GUIMARÃES, L. F. L., Cromatografia líquida de alta eficiência. In: Collins, C. H. & Braga, G. L.; Introdução a Métodos Cromatográficos, 3. ed., Ed. UNICAMP, São Paulo, 1988, p 179 - 243.

CIOLA, R., Fundamentos da Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho, , ed. Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 1998

Postado por Sterffson Jota

Desenvolvimento e validação de metodologia analítica por CLAE-IR para determinação de artemisinina em Artemisia annua L

Development and validation of an analytical method by HPLC-IR for determination of artemisinin in Artemisia annua L

A Artemisia annua L. (Asteraceae) é originária de regiões de clima temperado da Ásia e tem sido utilizada pela medicina tradicional chinesa há vários séculos no tratamento de malária. Pesquisadores chineses estudaram mais de 30 espécies do gênero Artemisia para confirmar a atividade antimalárica das mesmas. Somente A. annua e A. apiacea Hance foram eficazes em combater o Plasmodium vivax e o Plasmodium falciparum, agentes etimológicos da malária. 

A cromatografia líquida de alta eficiência CLAE tem sido amplamente empregada para quantificar a artemisinina e os compostos análogos, utilizando-se vários métodos de detecção. Zhao e Zeng e Qian et al., utilizaram a técnica de derivatização pré-coluna para converter a artemisinina em um composto com absorção no UV, aumentando o coeficiente de excitação para comprimentos de onda mais altos. Green et al. utilizaram o detector de quimioluminescência, determinando o limite de detecção de 2,5 ng; entretanto, a resposta do detector diminuiu muito para os derivados da artemisinina.

Vários autores utilizaram o detector eletroquímico para quantificar a artemisinina com boa sensibilidade e limites de detecção entre 1-10 ng. A utilização do detector eletroquímico requer que a detecção do analito ocorra em ausência de oxigênio; para isto, a fase móvel deve ser rigorosamente desoxigenada antes e durante a análise. O instrumento também deve ser mantido em condição completamente livre de oxigênio em todas as linhas e junções.

Avery et al. analisaram e quantificaram a artemisinina e seus derivados utilizando a cromatografia líquida com detecção de espalhamento de luz, com limite de detecção para os compostos na faixa entre 6 e 60 ng.

O método analítico proposto para determinação de artemisinina em amostras de Artemisia annua L., utilizando coluna com fase estacionária ciano e detecção por índice de refração, pode ser considerado como método alternativo, seletivo, exato, preciso, rápido e econômico quando comparado com a metodologia descrita por Qianet al. que utiliza detector UV e requer a etapa da derivatização para quantificação da artemisinina.

Fonte: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422009000400009&script=sci_arttext&tlng=ES

Postado por Glaycianne Alves

EXTRAÇÃO E DETERMINAÇÃO, POR CLAE, DE BIXINA E NORBIXINA EM COLORÍFICOS.

Um dos atributos mais importantes na comercialização de alimentos é o impacto visual causado pela cor. Entre os corantes , o urucum é o mais usado pela indústria brasileira. Do total de sementes de urucum industrializada no Brasil, 25% são utilizados na preparação dos extratos e o restante é empregado na fabricação do colorífico, consumido no mercado interno para o preparo doméstico de alimentos. A proposta deste trabalho foi determinar o teor de bixina e norbixina nos coloríficos de urucum existentes no mercado, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Empregaram-se, para tanto, coluna C18 (Spherisorb ODS-2, 150 x 4,6mm, 3μm) e acetonitrila:ácido acético 2% (65:35) como fase móvel com fluxo de 1mL/min. Os carotenóides foram identificados através do comportamento cromatográfico e espectros

no UV-visível fornecidos pelo detector de arranjos de diodos; e quantificados por padronização externa. Foram analisadas sete marcas diferentes de colorífico (de dois a cinco lotes de cada marca), totalizando vinte e cinco amostras. A bixina foi o carotenóide majoritário encontrado nas diferentes marcas de colorífico, em teores que variaram de 154 a 354mg/100g, enquanto a norbixina esteve presente em traços (2 a 9mg/100g).

A variação dos teores de carotenóides foi pequena entre lotes da mesma marca, enquanto foi observada uma grande diferença em relação às diferentes marcas analisadas.

Postado por Luma Mendes

Fonte: http://www.scielo.br/pdf/cta/v21n3/8548.pdf/ Luciane TOCCHINI2, Adriana Zerlotti MERCADANTE3,*/[1] ANGELUCCI, E. Corantes naturais versus corantes artificiais:

vantagens e desvantagens. In: Seminário de Corantes

Naturais para Alimentos, p. 8-10, 1989. Campinas.

Aplicações da cromatografia líquida de alta eficiência (Hplc)

Aplicações da cromatografia líquida de alta eficiência (Hplc)

Onde a cromatografia líquida de alta eficiência é aplicada:

Toxicologia, cosmético, fármacos, pesticidas, alimentos, proteínas, aminoácidos e corantes.

Postado por Alana de Jesus.

01/05/2014 - Quinta-feira.

3º Semestre - Farmácia.

CUIDADOS COM AS COLUNAS DA CLAE

CUIDADOS COM AS COLUNAS DA CLAE

       No emprego das colunas de partículas microporosas são necessárias algumas precauções.

      Em amostras muito sujas convém utilizar uma pré-coluna. A pré-coluna é uma coluna pequena com o mesmo recheio ou similar da camada porosa usada na coluna. Coloca-se entre o injetor e a coluna. As pré-colunas com esta finalidade geralmente são de 2 - 5 cm de comprimento com o mesmo diâmetro interno da própria coluna, para que apresentem as mesmas características de separação. Os solventes devem ter um alto grau de pureza para evitar a contaminação da coluna.

      Um outro cuidado importante e que os solventes devem ser filtrados, em filtros de 0.2 μm, para retirar partículas sólidas, que podem riscar o pistão ou a válvula injetora ou mesmo entupir os tubos do sistema. Solventes halogenados podem conter traços de HCl, HBr, etc., que podem reagir com o aço inoxidável da coluna e outras partes do sistema. Dependendo da natureza potencialmente corrosiva de cada solvente, eles podem também trazer problemas para a coluna, com a solubilização de íons metálicos.

Referência: ZANELLA, R.; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL). Disponível em: Acesso em: 3 maio 2014.

 ZANELLA, R.; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HLPC). Disponível em: <http://w3.ufsm.br/larp/media/hplc_geral_colorido.pdf>. Acessado em: 07 maio 2014

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL)

Referência: ZANELLA, R.; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL). Disponível em: Acesso em: 3 maio 2014.

Referência: ZANELLA, R.; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL). Disponível em: Acesso em: 3 maio 2014.

Referência: ZANELLA, R.; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL). Disponível em: Acesso em: 3 maio 2014.

Referência: ZANELLA, R.; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL). Disponível em: Acesso em: 3 maio 2014.

Postado por Ana Brígida

Como calibrar um CLAE

How to Calibrate an HPLC.

Cromatografia de HPLC é um teste líquido de alta eficiência forçando o solvente através de uma coluna sob alta pressão de até 400 atmosferas. A pressão arterial elevada faz com que este teste cromatográfica corra mais rápido do que outros métodos de detecção de cromatografia de testes para HPLC automatizada e sensível. A fim de realizar HPLC, um conjunto padrão de padrões de calibração que contêm os compostos específicos que executam testes não deve ser preparada utilizando uma curva de calibração.

Instruções

1. 1
   Prepara-se uma série de diluições para preparar os padrões de calibração contendo os compostos a serem analisados.Faça a escala padrão de 20 microgramas por mililitro de 100 microgramas por mililitro usando balões volumétricos. Use HPLC água para suas diluições. Se você está analisando a cafeína, por exemplo, deseja obter um padrão de cafeína diluído para criar uma curva padrão.
2. 2
   Prepare a amostra que deseja analisar no HPLC. Por exemplo, se você quer analisar cafeína, você pode optar por chá ou café.

3     Dilui-se a amostra com água de HPLC, de modo que ele se encontre no intervalo das suas amostras.

4     Injetar as amostras na coluna de HPLC. Siga as instruções específicas fornecidas pelo fabricante para uma determinada coluna.

5     Fazer um gráfico dos dados obtidos com as soluções padrão com a área do pico em função da concentração da amostra.

6     Determinar a concentração de cada componente presente em sua amostra a partir da curva padrão que você criou.

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                                                                                          Preparação para HPLC.

                                                                         química imagem por david hughes de Fotolia.com

Fonte: http://www.ehowenespanol.com/calibrar-hplc-como_98677/  Acesso em 06/05/2014.

Postado por Glaycianne Alves

3 Passos importantes na realização da CLAE (3/3)

3. Discutir os métodos de eluição por gradiente e isocrática:

Discuss methods for gradient elution and isocratic

Para ilustra nossa discussão, selecionamos um separação cromatográfica encontrada na bibliografia 3, onde temos uma separação por gradiente e outra isocrática. O modo de análise isocrática consiste em analisar uma amostra em que a fase móvel permanece em proporção constante durante toda a análise. O modo de eluição por gradiente consiste em uma modificação programada da proporção dos reagentes da fase móvel.

Podemos perceber que a ordem de eluição dos componentes permanece a mesma, porém a intensidade dos picos variou muito, temos que na análise por gradiente a maior intensidade de pico foi do pentaclorobenzeno já por análise isocrática foi do monoclorobezeno. Outro fator interessante é a proximidade dos picos gerando uma análise mais rápida pro gradiente.

Modo Tempo Proximidade entre os picos Resolução:

Gradiente Menor, devido a mudança da polaridade da fase móvel que assim gera uma rapidez na eluição de compostos de diferentes polaridades.

Mais próximos devido a tempo de eluição ser menor pela mudança de polaridade, isso pode ser uma vantagem pelo quesito tempo, mas também uma desvantagem devido à proximidade pode ocorrer sobreposições de picos.

Resolução satisfatória, porém os picos estavam razoavelmente próximos o que poderia geral uma possível sobreposição que no caso acima não ocorreu.

Isocrática Maior, devido a constante polaridade da fase móvel que assim gera uma maior tempo de eluição para composto de diferentes polaridades.

A proximidade entre os picos varia de próximos a distantes, com isso podemos determinar a polaridade dos compostos.

Resolução de qualidade ruim em relação aos últimos picos que apresentam caudas laterais.

A análise pelo modo de eluição por gradiente é mais conveniente devido sua rapidez e sua resolução, porém a análise isocrática é indicada para análise o compostos específicos.

A separação por cromatografia líquida de alta eficiência, proporção uma separação razoavelmente boa, porém esse equipamento é de custo elevado dependendo do tipo de coluna empregada e do detector. O trabalho sendo realizado em uma amostra real no caso de chá foi muito interessante devido a complexidade da amostra, e as perspectivas que obtivemos sobre o chá preto nas quais contribuem para a saúde e a qualidade de vida de pessoas com doenças crônicas.

 Fonte: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - Disponível em:< http://www.ebah.com.br/content/ABAAAeqmMAH/clae-cromatografia-liquida-alta-eficiencia>. Acesso em: 5 maio 2014.

Postado por: Sterffson Jota

Detectores para CLAE / Detectors of HLPC

Características  Gerais: 

•  Tem a função de monitorar o efluente da coluna e fornecer a medida detectada do soluto;

• Funciona de acordo com diferentes princípios, mas todos geram sinal elétrico que é proporcional a alguma propriedade do analito;

• A resposta do detector pode ser relacionada com a quantidade de analito, portanto o detector deve ser calibrado com cada espécie de interesse;

• A escolha do detector é de acordo com as características dos analitos.

Sistemas de Detecção:

• Qualquer propriedade química ou física que pode ser medida em solução pode, em princípio, ser utilizada para a detecção.

•  Propriedades da solução: mede alguma mudança ocorrida na FM. Ex. Índice de refração e eletroquímicos.

• Propriedades do soluto: mede uma propriedade específica do soluto. Ex. Espectrofotométrico UV-vis e DAD.

 Referência: ZANELLA, R.; Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPCL). Disponível em: <http://w3.ufsm.br/larp/media/hplc_geral_colorido.pdf> Acesso em: 3 maio 2014. 

Postado por Ana Brígida

DETECTORES POR ABSOBÂNCIA NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL

DETECTORES POR ABSOBÂNCIA NO ULTRAVIOLETA E NO VISÍVEL

Nos detectores espectrofotométricos o seu funcionamento baseia-se na absorbância de luz por parte da amostra ao passar através dela qualquer radiação eletromagnética; normalmente isto ocorre no ultravioleta até o infravermelho, em um dado comprimento de onda. Existem dois tipos de detectores de luz ultravioleta: o de comprimento de onda variável (espectrofotômetros), que não só é de aplicação mais variada e sensível, mas também é mais caro, e o chamado fotométrico que funciona com um ou dois comprimentos de onda fixos. Este último é sensível, econômico e mais que suficiente para se conseguir bons resultados com todos os compostos que absorvem luz no comprimento de onda em que ele funciona. Este tipo de detector é normalmente insensível a variações de vazão e temperatura. A maioria dos detectores de comprimento de onda fixo, oferecidos no mercado, operam em um comprimento de onda de 254 nm e um de 280 nm, resultado da absorbância de luz em 254 nm e da emissão de luz em 280 nm por uma substância fosforescente. Em ótimas condições, pode-se atingir sensibilidades de até 0,001 unidades de absorbância e, se o composto absorve intensamente na faixa de UV, é possível detectar quantidades de amostras da ordem de nanogramas (10-9 g). Quando se aplica gradiente na fase móvel e ela apresenta variação significativa de absorbância para o UV, é necessário utilizar a cela de referência para compensar esta variação. Se a fase móvel não absorve ou se a absorbância é constante, pode-se deixar a cela de referência vazia ou cheia com um dos componentes da fase móvel.

Postado por Alana de Jesus

dia 01/05/2014 - Quinta-feira

3ºSemestre - Farmácia